صفی‌الله افضلی، فرزند میرزا ذبیح‌الله افضلی غوریانی، در سال ۱۳۳۳ خورشیدی در روستای قیسان ولسوالی غوریان هرات به دنیا آمد. خانواده او در منابع نزدیک به افضلی، باسواد و دارای پیشینه عرفانی معرفی شده است.

آموزش ابتدایی را در زادگاهش، مسجد محل و مکتب ابتدایی قیسان آغاز کرد. خانواده او سپس به شهر هرات کوچید. صفی‌الله افضلی دوره متوسطه و لیسه را در لیسه جامی هرات گذراند و در سال ۱۳۵۳ از این مکتب فارغ شد.

افضلی در سال ۱۳۵۴ وارد دانشگاه کابل شد و در دانشکده ساینس، رشته بیولوژی را انتخاب کرد. او در خزان ۱۳۵۷ مدرک لیسانس خود را گرفت.

فعالیت سیاسی او پیش از ورود به دانشگاه آغاز شده بود. منابع زندگی‌نامه‌ای می‌نویسند که او از سال ۱۳۵۰ زیر تاثیر و راهنمایی برادر بزرگ‌ترش، حفیظ‌الله افضلی، به نهضت اسلامی پیوست. حفیظ‌الله افضلی دانش‌آموخته ژورنالیزم و ادبیات دانشگاه کابل بود.

حفیظ‌الله افضلی در سال ۱۳۵۴ در جریان قیام علیه محمد داوود خان در پنجشیر زخمی و بازداشت شد. او بعدا در زندان دهمزنگ کابل کشته شد. منابع نزدیک به خانواده افضلی می‌نویسند که این رویداد تاثیر عمیقی بر فعالیت‌های سیاسی صفی‌الله گذاشت.

صفی‌الله افضلی در محیط دانشگاه فعالیت‌های سیاسی و فرهنگی داشت. در میزان ۱۳۵۷ و چند ماه پس از کودتای هفت ثور، ماموران حکومت نورمحمد تره‌کی او را بازداشت کردند.

او برای تحقیق و بازجویی به وزارت داخله منتقل شد. منابع زندگی‌نامه‌ای نزدیک به او مدت زندانش را ۱۲ روز نوشته‌اند. افضلی پس از آزادی، دوره دانشگاه را تکمیل کرد و به هرات بازگشت.

پس از بازگشت به هرات، صفی‌الله افضلی با گروهی از فعالان سیاسی و مذهبی شهر ارتباط گرفت. منابع متعدد مرتبط با قیام ۲۴ حوت از او به عنوان یکی از دست‌اندرکاران و افراد موثر در طرح‌ریزی این حرکت نام برده‌اند.

قیام ۲۴ حوت ۱۳۵۷ از اعتراض‌های مردمی آغاز شد و با پیوستن بخشی از نیروهای نظامی به شورش گسترده تبدیل شد. حکومت وقت قیام را با نیروی هوایی و زمینی سرکوب کرد. پس از این رویداد، فعالیت‌های مسلحانه در مناطق مختلف هرات گسترش یافت.

صفی‌الله افضلی در ایجاد شورای شهری جهاد هرات سهم گرفت. با گسترش جنگ و پراکندگی گروه‌های مسلح، او با شماری از همراهانش یک جبهه مستقل را به نام برادرش، «جبهات شهید حفیظ‌الله افضلی»، ایجاد کرد.

نیروهای این جبهه بیشتر از میان جوانان شهری، دانش‌آموختگان و نزدیکان فکری افضلی سازمان یافتند. گزارش‌های زندگی‌نامه‌ای می‌نویسند که او در کنار فعالیت نظامی، برای ایجاد بخش‌های سیاسی، فرهنگی، آموزشی و اجتماعی نیز کوشید.

بخش مهمی از روایت‌هایی که درباره صفی‌الله افضلی منتشر شده، بر تلاش او برای همکاری میان گروه‌های جهادی تمرکز دارد. نزدیکانش می‌گویند او اختلاف تشکیلاتی را مانع همکاری در برابر حکومت وقت نمی‌دانست.

آمنه افضلی، همسر او، در یکی از مراسم‌های سالگرد کشته شدنش گفت که صلح و وحدت جامعه از هدف‌های مهم صفی‌الله افضلی بود. آمنه افضلی بعدها وزیر امور جوانان، وزیر کار و امور اجتماعی و عضو مجلس سنا شد.

صفی‌الله افضلی در ۱۶ سرطان ۱۳۶۶، برابر با هفتم جولای ۱۹۸۷، هنگام بازگشت از یک ماموریت در ایران هدف حمله قرار گرفت. این حمله در مسیر شاهراه تربت‌جام به تایباد روی داد.

محمدجمعه، مشهور به «سیاه»، و یارمحمد، مشهور به «زوری»، دو همراه او نیز در این حمله کشته شدند. صفی‌الله افضلی هنگام کشته شدن ۳۳ سال داشت.

پیکر صفی‌الله افضلی پس از انتقال به هرات به خاک سپرده شد. مراسم‌های یادبود او در سال‌های بعد با حضور اعضای خانواده، فرماندهان جهادی، فعالان مدنی و مقام‌های محلی برگزار شده است.